1. محیط کشت را آماده کنید: با تهیه یک محیط کشت مناسب که مواد مغذی لازم برای رشد باکتری ها را فراهم می کند، شروع کنید. این می تواند بسته به باکتری خاص مورد مطالعه متفاوت باشد.
2. محیط کشت را تلقیح کنید: مقدار کمی از نمونه باکتری را با استفاده از تکنیک استریل به محیط کشت آماده شده منتقل کنید. این تضمین می کند که فقط باکتری های مورد نظر وارد محیط می شوند.
3. انکوبه کردن کشت: محیط کشت تلقیح شده را در یک انکوباتور در دمای مطلوب برای رشد باکتری قرار دهید. این دما بسته به نوع باکتری مورد مطالعه می تواند متفاوت باشد.
4. نظارت بر رشد: به طور منظم کشت را برای علائم رشد باکتری، مانند کدورت یا افزایش قابل مشاهده تراکم سلولی بررسی کنید. این را می توان با بازرسی بصری یا با اندازه گیری چگالی نوری با استفاده از اسپکتروفتومتر انجام داد.
5. نمونه گیری: نمونه های دوره ای از کشت را در فواصل زمانی مشخص برای اندازه گیری رشد باکتری ها بگیرید. دفعات نمونه برداری به سرعت رشد باکتری و مدت زمان آزمایش بستگی دارد.
6. رقیق سازی: اگر جمعیت باکتری بیش از حد متراکم شود، ممکن است لازم باشد نمونه را رقیق کنیم تا در محدوده قابل اندازه گیری قرار گیرد. رقیق کردن امکان شمارش دقیق و کمیت سلول های باکتریایی را فراهم می کند.
7. روش شمارش بشقاب: یکی از روش های رایج برای اندازه گیری رشد باکتری، روش شمارش پلیت است. این شامل رقیق کردن سریال و پخش آن بر روی صفحات آگار است. پس از انکوباسیون، کلنی ها شمارش می شوند و واحدهای تشکیل دهنده کلنی (CFU) تعیین می شوند.
8. اندازه‌گیری چگالی نوری: یکی دیگر از روش‌های پرکاربرد، اندازه‌گیری چگالی نوری (OD) با استفاده از اسپکتروفتومتر است. کشت های باکتریایی نور را پراکنده می کنند و این پراکندگی را می توان به عنوان قرائت های OD تعیین کرد که با تراکم سلولی مرتبط است.
9. فلوسایتومتری: فلوسیتومتری یک تکنیک قدرتمند است که می تواند به سرعت جمعیت باکتری ها را بر اساس اندازه و خواص فلورسانس آن ها تجزیه و تحلیل و کمیت کند. اطلاعات دقیقی در مورد اندازه سلول، زنده بودن و سایر پارامترها ارائه می دهد.
10. اندازه گیری زیست توده: رشد باکتری را می توان با اندازه گیری زیست توده تولید شده در طول رشد نیز تخمین زد. این کار را می توان با خشک کردن و وزن کردن سلول های باکتریایی یا با اندازه گیری محتوای پروتئین با استفاده از روش های رنگ سنجی انجام داد.
11. رنگ‌آمیزی زنده/مرده: برای ارزیابی زنده‌مانی باکتری، می‌توان از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی زنده/مرده استفاده کرد. این روش ها از رنگ های فلورسنت استفاده می کنند که بین سلول های زنده و مرده بر اساس یکپارچگی غشاء تمایز قائل می شوند.
12. تجزیه و تحلیل داده ها: هنگامی که اندازه گیری ها به دست آمد، می توان از تکنیک های تجزیه و تحلیل داده ها مانند منحنی های رشد، تجزیه و تحلیل آماری و مدل سازی ریاضی برای تفسیر نتایج و درک پویایی رشد باکتری استفاده کرد.

20 نکته برای بهینه سازی اندازه گیری رشد باکتری:

1. از محیط کشت مناسب متناسب با سویه یا گونه باکتری خاص مورد مطالعه استفاده کنید.
2. از عقیمی در طول فرآیند آزمایشی برای جلوگیری از آلودگی اطمینان حاصل کنید.
3. شرایط جوجه کشی ثابت، از جمله دما، رطوبت، و سطح اکسیژن را حفظ کنید.
4. به طور منظم هر ابزاری را که برای اندازه گیری رشد باکتری استفاده می شود کالیبره و اعتبارسنجی کنید.
5. تکنیک‌های نمونه‌گیری را برای به دست آوردن نمونه‌های نماینده در هر نقطه زمانی استاندارد کنید.
6. برای به حداقل رساندن زمان نگهداری نمونه و جلوگیری از قرار گرفتن طولانی مدت در شرایط محیطی، اقدامات احتیاطی را انجام دهید.
7. فاکتور رقت را بهینه کنید تا مطمئن شوید که کلنی های باکتری یا تراکم سلولی در محدوده قابل اندازه گیری قرار می گیرند.
8. کنترل های مناسب را برای در نظر گرفتن نویز پس زمینه یا سیگنال های غیر اختصاصی در روش های اندازه گیری انجام دهید.
9. از تکنیک‌های اندازه‌گیری چندگانه (مانند روش شمارش صفحه، چگالی نوری، فلوسیتومتری) برای اعتبارسنجی متقاطع نتایج استفاده کنید.
10. سوابق دقیقی از همه شرایط آزمایشی و روش‌های تکرارپذیری نگهداری کنید.
11. استفاده از سیستم‌های خودکار برای جابجایی و اندازه‌گیری نمونه برای افزایش توان عملیاتی و کاهش خطای انسانی را در نظر بگیرید.
12. دقت و دقت سیستم‌های خودکار مورد استفاده برای اندازه‌گیری رشد باکتری را تأیید کنید.
13. روش های آماده سازی نمونه را برای اطمینان از توزیع یکنواخت باکتری ها در محیط کشت بهینه کنید.
14. از تکنیک‌ها و کنترل‌های رنگ‌آمیزی مناسب برای ارزیابی زنده‌مانی برای به دست آوردن نتایج قابل اعتماد استفاده کنید.
15. آزمایش‌های رشد را در سه یا چند تکرار انجام دهید تا تنوع بیولوژیکی را در نظر بگیرید.
16. روش های تحلیل آماری مناسب را برای تعیین اهمیت تفاوت های مشاهده شده در رشد باکتری ها اجرا کنید.
17. به طور منظم aو کیفیت محیط کشت، معرف‌ها و تجهیزات مورد استفاده در آزمایش‌ها را حفظ کنید.
18. استفاده از سیستم‌های نظارت مستمر را در نظر بگیرید که اندازه‌گیری در زمان واقعی رشد باکتری را ارائه می‌دهند.
19. برای بهینه‌سازی پروتکل‌های آزمایشی، با کارشناسان این حوزه همکاری کنید یا با متون مرتبط مشورت کنید.
20. روش های آزمایشی را بر اساس بازخورد و پیشرفت های علمی جدید به طور مداوم به روز و اصلاح کنید.

روش های جدید برای اندازه گیری رشد باکتری ها:

1. دستگاه‌های میکروفلوئیدی: دستگاه‌های میکروسیال کنترل دقیقی بر شرایط کشت ارائه می‌دهند و اندازه‌گیری با توان بالای رشد باکتری را در سطح تک سلولی امکان‌پذیر می‌کنند.
2. حسگرهای زیستی: حسگرهای زیستی را می‌توان برای شناسایی مولکول‌های خاصی که در طول رشد باکتری‌ها تولید می‌شوند مهندسی کرد و امکان نظارت در زمان واقعی را بدون نیاز به نمونه‌برداری فراهم می‌کند.
3. طیف‌سنجی امپدانس الکتریکی: این تکنیک تغییرات امپدانس الکتریکی ناشی از رشد باکتری را اندازه‌گیری می‌کند و روشی بدون برچسب و غیر مخرب برای نظارت بر تکثیر سلولی ارائه می‌دهد.
4. تصویربرداری تشدید پلاسمون سطحی: تصویربرداری تشدید پلاسمون سطحی را می توان برای مطالعه چسبندگی باکتری ها و تشکیل بیوفیلم مورد استفاده قرار داد و بینش هایی را در مورد پویایی رشد و برهمکنش های سطحی ارائه کرد.
5. توالی یابی نانوحفره: فناوری توالی یابی نانوحفره را می توان برای نظارت بر تغییرات در محتوای DNA یا RNA در طول رشد باکتری مورد استفاده قرار داد و امکان تجزیه و تحلیل بلادرنگ تغییرات ژنتیکی را فراهم می کند.
6. طیف‌سنجی رامان: طیف‌سنجی رامان اندازه‌گیری بدون برچسب و غیرمخرب رشد باکتری را با تجزیه و تحلیل حالت‌های ارتعاشی مولکول‌های زیستی امکان‌پذیر می‌کند.
7. میکروبالان کریستال کوارتز: میکروبالانس کریستال کوارتز تغییرات جرم روی سطح حسگر را به دلیل رشد باکتری اندازه گیری می کند و روشی حساس برای نظارت در زمان واقعی ارائه می دهد.
8. میکروسکوپ هولوگرافی دیجیتال: میکروسکوپ هولوگرافی دیجیتال تصویربرداری فاز کمی از سلول‌های باکتریایی را فراهم می‌کند و امکان اندازه‌گیری رشد بدون برچسب و غیرتهاجمی را فراهم می‌کند.
9. ریز تنفس سنجی: میکرورسپیرومتری میزان مصرف اکسیژن در کشت های باکتریایی را اندازه گیری می کند و اطلاعاتی در مورد فعالیت متابولیک و سینتیک رشد ارائه می دهد.
10. تکنیک‌های برچسب‌گذاری ایزوتوپ: تکنیک‌های برچسب‌گذاری ایزوتوپی، مانند کاوشگر ایزوتوپ پایدار، می‌توانند ادغام بسترهای برچسب‌دار در زیست توده باکتریایی را ردیابی کنند و امکان اندازه‌گیری مستقیم نرخ رشد را فراهم کنند.
11. میکرو کالریمتری: میکروکالریمتری گرمای تولید شده در طول رشد باکتری را اندازه گیری می کند و بینشی در مورد فعالیت متابولیک و پویایی رشد ارائه می دهد.
12. تصویربرداری با توان بالا: سیستم های تصویربرداری با توان بالا می توانند تصاویری از چندین چاه یا نمونه را به طور همزمان ضبط کنند و امکان اندازه گیری سریع رشد باکتری ها را در آزمایشات در مقیاس بزرگ فراهم کنند.

منابع :‌

1. Nature - یک مجله علمی مشهور که تحقیقات پرتأثیر را در رشته‌های مختلف از جمله میکروبیولوژی و بیوتکنولوژی منتشر می‌کند.
2. Journal of Bacteriology - مجله ای با داوری که به انتشار مقالات تحقیقاتی اصلی در مورد همه جنبه های زیست شناسی باکتری اختصاص دارد.
3. انجمن میکروبیولوژی آمریکا (ASM) - یک سازمان حرفه ای که منابع ارزشمندی را ارائه می دهد و مجلات مرتبط با تحقیقات میکروبیولوژی، از جمله تکنیک های اندازه گیری رشد باکتری را منتشر می کند.